非變性蛋白電泳Marker轉(zhuǎn)膜問題
非變性蛋白電泳Marker轉(zhuǎn)膜問題
1. 所有的預(yù)染蛋白Marker都是變性Marker，不適用于非變性電泳。
2. 蛋白非變性電泳條件下，不能精確判斷蛋白的分子量大小。因?yàn)樵诜亲冃詶l件下，蛋白的電荷，空間結(jié)構(gòu)，物化性質(zhì)等都對蛋白的遷移有影響。
3. 非變性蛋白電泳Marker（RTD6137，RTD6142，RTD6144）由于要保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)，都沒有偶聯(lián)染料，在電泳時基本都看不到條帶；然而，RTD6137和RTD6144中的440 kD和880 kD由于天然蛋白中含有鐵離子，使得電泳后在膠上可見淡黃色，其中440 kD顏色更深。凝膠轉(zhuǎn)膜后，膜上也可以看到黃色的440 kD條帶（下圖），可以大體判斷Marker轉(zhuǎn)膜的效果。
4. 有兩種方法可以解決非變性Marker轉(zhuǎn)膜后條帶顯示問題：
第一種方法：凝膠轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色液（貨號：RTD6301）染膜，可以看到Marker條帶，順便可以檢測轉(zhuǎn)膜效率，然而要注意的是麗春紅染色靈敏度比較低，可能不能完全看到完整的Marker條帶。
注：北京師范大學(xué)惠贈圖片
第二種方法（下圖）：電泳結(jié)束后，把含有Marker泳道的凝膠切下，單獨(dú)用考馬斯亮藍(lán)染色液染色（貨號：RTD6202），剩余的凝膠去完成轉(zhuǎn)膜到ECL發(fā)光檢測過程，最后的發(fā)光結(jié)果和Marker染色結(jié)果拼接判斷條帶范圍。
Jurkat 無去垢劑提取TP，GAPDH檢測（pI~8.6）：
凝膠：RTD6139-0416 BN預(yù)制膠
電泳：1×藍(lán)色電泳緩沖液（含0.002% G-250）
穩(wěn)壓150V 45分鐘；1×無色電泳緩沖液 穩(wěn)壓150V 46分鐘
膠浸泡：1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（含20%甲醇）+0.1%SDS浸泡10分鐘
轉(zhuǎn)膜：1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（含20%甲醇），穩(wěn)流200 mA
（電壓89-81V） 1.5小時，未冰浴
膜漂洗去藍(lán)色：PVDF膜無水甲醇浸泡10分鐘至膜無色
封閉：無蛋白快速封閉，RT，30分鐘
一抗：GAPDH抗體，1：5000 RT 一小時
二抗：羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 1.5小時
ECL：ECL發(fā)光，機(jī)器拍照，曝光2min